Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) – цитогенетический метод исследования, в процессе которого детектируется наличие и локализация специфических ДНК-последовательностей на хромосомах. Ген Bсl-6 подавляет гены, участвующие в В-клеточной активации и терминальной дифференцировке лимфоцитов. При диффузной В-крупноклеточной лимфоме в этом гене происходят перестройки, которые полностью блокируют его функцию. В результате, лимфоциты формируют клон опухолевых клеток. Исследование важно как для диагностики диффузной В-крупноклеточной лимфомы, так и для прогноза течения заболевания.
Синонимы русские
Флуоресцентная гибридизация in situ, молекулярная диагностика онкогематологических заболеваний, диффузная В-крупноклеточная лимфома
Синонимы английские
Analysis of the Bcl-6 gene aberrations on paraffin slides (FISH Histology, quantitative), Bcl-6 gene translocation, Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL).
Метод исследования
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
Материал для исследования
Образец ткани в парафиновом блоке
Как правильно подготовиться к исследованию?
Специальной подготовки не требуется. Для исследования используется уже предварительно подготовленный биологический материал (парафиновый блок с образцом биоматериала).
Преимущества исследования
Общая информация об исследовании
Анализ с помощью флюоресцентной in situ гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH) – молекулярно‐цитогенетический метод для идентификации генетических аберраций (отклонений от нормы). Изначально данный метод использовался как исследовательский для выявления наличия или отсутствия специфической ДНК последовательности в хромосомах, но благодаря прогностической и предсказательной ценности был внедрен в клиническую практику.
Метод основан на использовании флуоресцентномеченых ДНК-зондов, которые представляют собой искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. ДНК-зонды различаются по специфичности: для каждой хромосомной аномалии используются свои ДНК-зонды. Также зонды различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие – к конкретному локусу (фрагменту хромосомы или гена).
После специальной процедуры – денатурации – молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. ДНК-зонд гибридизуется (связывается) с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа. Данное состояние интерпретируется как положительный результат FISH-теста. При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-зонды в ходе реакции "отмываются", что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест – это еще и количественный метод.
FISH имеет широкие возможности в клинической онкологии для обнаружения хромосомных аномалий в опухолевых клетках. Метод позволяет исследовать генетический состав клетки, как во время митоза, так и в интерфазе. FISH имеет высокую чувствительность – позволяет обнаружить индивидуальные гены, кроме того, в одном препарате могут быть использованы несколько зондов с различными красителями.
FISH-анализ широко применяется при лимфопролиферативных заболеваниях, являясь в ряде случаев определяющим фактором для подтверждения диагноза.
Диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВКЛ) – самый распространенный вариант неходжкинской лимфомы (30-50 % от всех случае). Она является гетерогенной группой лимфатических опухолей с различными клиническими, морфологическими, иммунофенотипическими, цитогенетическими проявлениями. Риск развития опухоли увеличивается с возрастом и значительно выше у людей с серопозитивностью на вирус гепатита С, при наличии вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), при аутоиммунных заболеваниях. У мужчин и женщин ДВКЛ встречается приблизительно с равной частотой.
Субстратом опухоли являются атипичные В-лимфоидные клетки, для которых характерна экспрессия как общих антигенов В-лимфоцитов, так и антигенов активированных В-лимфоцитов. В большинстве случаев опухолевые клетки располагаются диффузно, но могут быть и разбросанными среди зрелых В-лимфоцитов или формировать очаговые скопления. Очаги опухолевого роста могут располагаться как в лимфоузлах (особенно на шее и в брюшной полости), так и экстранодально (примерно в 30 % случаев) с поражением ЖКТ, яичек, костей, щитовидной и слюнных желез, кожи, головного мозга. При ДВКЛ наблюдается высокая предрасположенность к инфильтрирующему росту, что чревато прорастанием сосудов, дыхательных путей и нервов, разрушением костей. Поражение костного мозга в начале заболевания бывает лишь у 10-20 % больных. Важно своевременно выявить заболевание, так как на поздних стадиях возможны метастазы в ЦНС, печень, почки и легкие, а также тяжелое поражение костного мозга.
В патогенезе ДВКЛ наиболее изученным является механизм перестройки гена Bcl-6, который отвечает за активацию одного из механизмов апоптоза. Ген Bcl-6 расположен в локусе 3q27 и экспрессируется исключительно В-клетками зародышевого центра. В физиологических условиях ген Bcl-6 связывается с определенными регулирующими последовательностями ДНК, влияет на транскрипцию других генов, участвующих в В-клеточной активации и терминальной дифференцировке лимфоцитов. При диффузной В-крупноклеточной лимфоме происходит перестройка локуса 3q27, в результате блокируется дифференцировка В-клеток в плазматические клетки, что приводит к бесконтрольной пролиферации В-клеток зародышевого центра и формированию клона опухолевых клеток. Таким образом, исследование перестроек гена важно для диагностики диффузной В-крупноклеточной лимфомы.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты исследования?
Референсные значения:
Отсутствие аберрантных хромосом в исследуемом образце.
Наиболее агрессивным вариантом В-крупноклеточных опухолей является лимфома с перестройками нескольких генов: MYC в сочетании с генами BCL2, так называемые "double-hit" (DHL) и/или BCL6 "triple-hit" (THL) лимфомы. Частота выявления этих опухолей составляет 10 % от всех случаев диффузной В-крупноклеточной лимфомы. В качестве возможной причины столь агрессивного поведения опухолей рассматривается синергизм воздействия онкогенов.
В качестве диагностического, прогностического и прогнозирующего биомаркера ген MYC играет ключевую роль в агрессивных В-клеточных лимфомах, а его точное обнаружение важно для при выборе терапии. Определение транслокаций генов MYC, BCL2 и BCL6 является важным этапом диагностики агрессивных В-клеточных лимфом.
Экспрессия белка MYC при ДВКЛ определяется гораздо чаще (в 30-50 % случаев ДВКЛ), чем транслокации MYC, и ассоциируется с сопутствующей экспрессией BCL2 в 20-35 % случаев. Такие опухоли без транслокаций MYC/BCL2, но с повышенной экспрессией MYC и BCL2 называются "double-expressor" лимфомами (лимфомами с двойной экспрессией).
Отмечается, что прогноз при лимфомах с двойной экспрессией хуже, чем при других ДВКЛ, но они не столь агрессивны, с перестройкой генов MYC и BCL2 и/или BCL6. Эти данные свидетельствуют, что двойная экспрессия белков MYC и BCL2 без изменений генов может быть важным прогностическим фактором при ДВККЛ.
Кто назначает исследование?
Гематолог, онколог.
Также рекомендуется
[02-043] Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с обязательной микроскопией мазка крови)
[02-027] Ретикулоциты
[12-077] Морфологическое исследование трепанобиоптата костного мозга
[16-012] Цитогенетический анализ клеток костного мозга (кариотип)
[07-009] anti-HCV, антитела
[20-067] Иммунологическое обследование первичное
[18-124] FISH-анализ перестроек MYC гена (t(8;14)(q24;q32)t(2;8)(p11;q24)t(8 ;22)(q24;q11))
Литература
